Vantagens e desvantagens das diferentes ferramentas moleculares para avaliação da disbiose intestinal em cães e gatos

Disbiose em cães e gatos

 A disbiose, em cães, pode ser caracterizada pelo aumento na abundância de bactérias anaeróbicas facultativas da família Enterobacteriaceae (Vazquez-Baeza et al., 2016) e pela redução de Faecalibacterium, Fusobacterium e Clostridium hiranonis (Pilla & Suchodolski, 2021). Esse desequilíbrio pode estar associado a várias afecções como diarreia (GUARD et al., 2015), doença inflamatória intestinal (DUBOC et al., 2013), insuficiência pancreática exócrina (BLAKE et al., 2019), obesidade (Kieler et al., 2017), disfunções neurológicas (Jeffery et al., 2017), entre outras. Porém, para cada alteração metabólica é necessário o conhecimento das famílias de bactérias que são moduladas pela doença, a fim de realizar um diagnóstico coerente e preciso. Sabe-se que cães com diarreia aguda apresentaram maiores populações do gênero Clostridium (53,8%) em comparação com cães saudáveis (16,0%) e, menores populações de Bacteroidetes (27,9%), Faecalbacterium (1,1%) e um gênero não identificado dentro da Ruminococcaceae (0,2%). Já em cães saudáveis, os gêneros mais expressivos foram Prevotella spp. (25,1%), Blautia spp. (25,2%), Faecalibacterium spp. (5,4%), Eubacterium spp. (3,8%) e as famílias Ruminococcaceae (0,3%), Lachnospiraceae (6,7%), Clostridia (0,9%) e Coprobacillaceae (2,6%) (GUARD et al., 2015).

Em gatos, há poucos estudos sobre a microbiota e seu desequilíbrio bacteriano. É de conhecimento que, dependendo do grau de disbiose, há mudança no equilíbrio entre os pools bacterianos gram-positivos e gram-negativos e na quantidade dessas bactérias. Além disso, um trabalho identificou os fatores etiológicos de acordo com o grau de disbiose (BUGROV et al., 2022). Neste estudo, os autores relataram que em gatos com grau 1 de disbiose intestinal, o fator etiológico era alimentar. Já no grau dois, a disbiose foi consequente a fármacos (43,7%), pós-operação (25,0%), invasão (18,8%) e alimentação (12,5%). Por fim, no grau 3, o fator etiológico era por medicamentos (93,3%). Todavia, os dados comprovaram a redução das bactérias entéricas, Estafilococos, Estreptococos, Pseudomonas, Citrobacteri e enterobactérias, bem como fungos do gênero Candida, em amostras fecais de gatos com disbiose intestinal. Não só a identificação do fator etiológico da disbiose, mas também o método de avaliação da disbiose influenciam no manejo dietético.

Métodos para cálculo de disbiose

Atualmente, existem algumas técnicas moleculares para a detecção da microbiota intestinal em cães e gatos como o PCR, sequenciamento por MiSeq Illumina e pirosequenciamento. Em cada uma dessas técnicas, podemos identificar e calcular a disbiose intestinal. Porém, hoje existem quatro métodos para calcular a disbiose e cada um deles com suas vantagens e desvantagens. O que não podemos realizar é a comparação da disbiose intestinal de humanos com animais de companhia devido às divergências na comunidade bacterianas de cada espécie (Vazquez-Baeza et al., 2016). O primeiro método, o qual não é muito utilizado devido a imprecisão na identificação da disbiose pela baixa sensibilidade e falsos negativos, é pela dosagem da cobalamina e folato. Segundo Kather et al. (2020), esse método pode sugerir disbiose intestinal, uma vez que as bactérias produzem ácido fólico e competem com o hospedeiro pela cobalamina ingerida via alimento.

O segundo e o terceiro métodos foram utilizados primeiramente em humanos e, após estudos, foram realizados em animais de companhia. A análise se baseia na avaliação da diversidade de bactérias dentro da amostra (α-diversidade) e entre amostras (β-diversidade) e na identificação de taxas bacterianas específicas que podem atuar como biomarcadores para o processo biológico em questão. Em humanos com doença inflamatória intestinal (DII) foi identificada redução de Faecalibacterium prausnitzii e na relação Firmicutes/Bacteroidetes, o que indica a Faecalibacterium prausnitzii como biomarcador para essa alteração (Sokol et al.2009). Esse índice de disbiose (ID) é definido como o logaritmo da relação entre a abundância total em organismos aumentados em uma determinada doença e a abundância total de organismos diminuída na doença (Gevers et al., 2014). As vantagens desse método é que não há a necessidade de ferramentas moleculares de elevado custo, mas, em contrapartida, é necessário conhecimento específico das bactérias que causam o desequilíbrio no processo biológico a ser estudado. Isso pode dificultar o avanço no possível tratamento dietético em doenças que ainda não possuem a identificação das bactérias na disbiose. Já o método conhecido como teste GA-map’ utiliza 54 sondas de DNA nas regiões V3 a V7 para a medição de bactérias em vários níveis taxonômicos, a qual avalia de forma algorítmica a abundância e perfil bacteriano fecal. Isso permite o mapeamento do perfil da microbiota intestinal para um conjunto selecionado de bactérias, o qual é usado para identificar e caracterizar a disbiose em um ambiente clínico. Segundo Cansen et al. (2015), as sondas utilizadas nesse teste são extremamente seletivas e específicas, são usadas com um único algoritmo, a fim de facilitar a determinação do nível de disbiose. Esse método fornece concordância na captura de bactérias, análise rápida e de elevado rendimento de um número grande de amostras fecais individuais. Todavia, os autores verificaram correlações fracas para as seguintes bactérias Bacteroidetes fragilis, Ruminococcus albus/bromii e Streptococcus sanguinis/thermophilus, possivelmente devido à falta de detecção seletiva de espécies pelo seqüenciamento MiSeq Illumina.

Por fim, o método mais atual é por meio do índice de disbiose (ID), definido como a diferença entre a distância euclidiana entre a amostra teste e o centróide da classe saudável e, distância euclidiana entre a amostra teste e o centróide da classe doente (AlShawaqfeh et al., 2017). O ID se correlaciona com os resultados do sequenciamento do gene 16S rRNA e apresenta correlação negativa com a riqueza das espécies bacterianas, ou seja, um ID mais alto indica menor diversidade microbiana (Suchodolski, 2021). Um único valor numérico é utilizado, que mede a proximidade no modelo matemático l2 à média de cada classe. O cálculo de ID em um teste molecular é definido como: ID (z;μCD,μCH)=∥z−μCH∥2− ∥z−μCD∥2, Onde μCD e μCH representam o centroide das amostras doentes e saudáveis no conjunto de treinamento, respectivamente. Índices negativos correspondem a normobiose; valores entre zero e dois são considerados inespecíficos e valores positivos maiores que dois são sugestivos de disbiose. Esse método alcançou cerca de 74,0% de sensibilidade e 95% de especificidade em um estudo com cães saudáveis e cães com enteropatias inflamatórias crônicas (AlShawaqfeh et al., 2017). Como vantagens, possui menor tempo de análise (cerca de 1 dia), maior precisão, demonstra melhor separação entre os grupos do que apenas os ensaios individuais. Porém, é uma análise realizada somente nos Estados Unidos e possui um elevado custo operacional.

A representação do ID está ilustrada na figura 1. Além desses métodos, os processos de cultivo às bactérias também podem alterar os resultados. Werner et al. (2020) verificaram que a cultura bacteriana tradicional, realizada em laboratórios de diagnóstico veterinário, subestimam o número de bactérias intestinais devido ao uso de métodos anaeróbicos limitados. Isso porque a maioria das bactérias intestinais são anaeróbios estritos, o que demanda uma combinação de ferramentas moleculares descritas anteriormente para esse cultivo específico.

Figura 1. Representação do ID.